微流控生物反應器內的真菌代謝物篩選

作為(wei) 無柄生物，植物不能輕易通過搬遷來規避壓力源。為(wei) 了評估所經曆的非生物和生物脅迫的質量和數量，植物已經進化出複雜的信號通路。通常，屬於(yu) 潛在病原體(ti) 的分子是在植物質膜的水平上被識別出來的。識別後，信號從(cong) 細胞外部傳(chuan) 遞到細胞中，最終誘導防禦反應（如果可能的話）。在病原體(ti) 觸發免疫 （PTI） 中，一種基礎防禦反應，信號通常在二級信使 Ca 的幫助下傳(chuan) 遞2+.細胞外間隙含有相對高濃度的 Ca2+，尤其是與(yu) 細胞質中的濃度並列時。為(wei) 了對病原體(ti) 的存在做出反應，Ca2+離子被轉運到細胞中，在轉錄因子的幫助下改變細胞的行為(wei) 。這個(ge) Ca 的導入2+與(yu) H 跨質膜的轉運一起發生。質子的轉運導致細胞外 pH 值的變化，這很容易量化。pH 值變化是評估植物是否發生 PTI 反應的常用讀數。

為(wei) 了快速連續篩選多種真菌代謝物的免疫活性，需要一個(ge) 簡單可靠的係統來測量微流體(ti) 生物反應器 （MBR） 中的 pH 值變化，該係統由 KIT 微結構技術研究所 （IMT） 與(yu) KIT 植物研究所合作開發。因此，設計了一個(ge) 從(cong) 到 MBR 中相應的可伸縮但可密封的連接器，並在機械和生物實驗中進行了檢查。MBR 是一種用於(yu) 培養(yang) 植物細胞的雙室生物反應器（見圖 1A）。透膜將培養(yang) 室和營養(yang) 流室隔開。它最初是由 IMT 的 Tim Finkbeiner 設計的，然後進一步發展。細胞可以通過橢圓形腔室兩(liang) 端的兩(liang) 個(ge) 開口帶入培養(yang) 室。開口配有 M5 螺紋，以便用合適的螺釘密封。MBR 可以通過單向流連接到更多的 MBR。因此，留在培養(yang) 室中的細胞持續獲得來自先前 MBR 的新鮮培養(yang) 基和代謝產(chan) 物，同時它們(men) 自身的代謝產(chan) 物被運輸到下一個(ge) MBR 並帶走廢物。基本原理是剖析細胞間通訊通路，通過每個(ge) MBR 培養(yang) 一種細胞來獲取有關(guan) 所涉及的過程和反應的信息。在 MBR 的培養(yang) 室中培養(yang) Nicotiana tabacum 的 BY2 係細胞時，通過 pH-1 SMA HP5 定量 pH 值。可以將要評估免疫活性的物質添加到供應給細胞的培養(yang) 基中。如果可以觀察到 pH 值的增加，則可以將其解釋為(wei) 目標物質免疫活性的第一個(ge) 跡象。

圖 1：（MBR）：A） MBR 的頂視圖和側(ce) 視圖示意圖。它由兩(liang) 個(ge) 腔室組成，由半透膜隔開，僅(jin) 允許介質和溶劑通過。B） MBR 和傳(chuan) 感器的設置：通過一個(ge) 連接器安裝，該連接器擰入培養(yang) 室兩(liang) 個(ge) 螺紋開口的右側(ce) （在這種情況下，第二個(ge) 開口覆蓋有 851 型 3M 聚酯膠帶）。傳(chuan) 感器點通過玻璃纖維連接到測量設備 pH-1 SMA HP5 上。

結論

從(cong) 我們(men) 的實驗結果和不同的設計中，我們(men) 得出結論，通過不同連接器設計的透光率似乎並沒有顯著影響測量。然而，與(yu) 通過玻璃燒杯進行的參考測量相比，聚合物連接器測得的 pH 值似乎發生了變化。由於(yu) 玻璃是傳(chuan) 感器指南中規定的適當反應器材料，因此可能需要進行特殊校準來應對玻璃中的光折射，這會(hui) 導致使用聚合物時測量值發生變化。如果這種變化可以得到驗證 - 可能通過更多和不同的設置測試 - 並且考慮到 的相應位置將適合測量我們(men) MBR 中的 pH 值。

在之前的實驗中，我們(men) 通過使用使用電極的台式 pH 計測量 pH 值，證實了 25 μg/mL 殼聚糖會(hui) 導致 BY2 細胞中細胞外 pH 值升高。使用相同的處理，這項工作旨在證明 MBR 和 係統的組合可用於(yu) 觀察與(yu) 免疫反應相關(guan) 的細胞外 pH 值增加。開始處理後，15 分鍾後觀察到 pH 值顯著升高。這種延遲可以通過處理後的 MS 需要泵入 MBR 的時間來解釋。觀察到的 pH 值變化表明該方法可用於(yu) 篩選植物細胞上物質的免疫活性。通過使用多個(ge) 通道和傳(chuan) 感器點，將有可能建立高通量 篩選方法。此外，我們(men) 研究了由於(yu) 腔室的橢圓形，MBR 培養(yang) 室中營養(yang) 梯度的發展。關(guan) 於(yu) 此評估，在更大區域（例如，使用 VisiSens 係統）中分析 pH 值將很有趣。然而，傳(chuan) 感器箔必須打孔，營養(yang) 流才能到達培養(yang) 室，並且必須建立傳(chuan) 感器箔的安裝過程。