O2、pH 值和 CO2使用 PreSens SensorPlugs 傳感係統監測大腸杆菌培養物。

我們(men) 測試了 在微流體(ti) 生物反應器 （MB） 中監測細菌培養(yang) 物的功效，這在監測培養(yang) 肉生物工藝中的潛在汙染時非常重要。 大腸杆菌 （ATCC® 25922™） 在帶有集成 SensorPlugs 的定製 MB 中培養(yang) 。光學測量顯示了大腸杆菌生長的特征過程，並允許隨時精確評估當前的培養(yang) 狀態。

細胞培養(yang) 基是培養(yang) 肉生產(chan) 中最重要的成本驅動因素。通過傳(chuan) 感器的額外監測功能優(you) 化生物反應器的設計和儀(yi) 器，有助於(yu) 降低這些成本並實現每單位培養(yang) 基體(ti) 積的最大細胞生產(chan) 能力。

長期以來，生物工藝中一直采用按比例縮小的方法來解決(jue) 放大問題。小型化生物反應器作為(wei) 一種在早期工藝開發中獲取工藝相關(guan) 數據的工具而蓬勃發展。我們(men) 在開發新一代低成本傳(chuan) 感器時應用了這一原理，即“芯片實驗室"（LoC） 方法，用於(yu) 監測細胞培養(yang) 基中的各種細胞培養(yang) 參數，例如生物量、氨和穀氨酰胺。

我們(men) 使用定製的微流體(ti) 生物反應器，並輔以我們(men) 的阻抗傳(chuan) 感器和光學傳(chuan) 感器，並結合 O 傳(chuan) 感器插頭2， CO2和 pH 值，由 PreSens 提供。我們(men) 項目的主要思想是嚐試確定微流控生物反應器內(nei) 部正在進行的過程，並能夠量化對細胞行為(wei) 、細胞活力和試劑有效性的影響。我們(men) 測試了 在微流控生物反應器中監測細菌和哺乳動物細胞培養(yang) 物的功效。此外，我們(men) 還用人類唾液進行了一組試點實驗，作為(wei) 傳(chuan) 感器在培育肉生物工藝最終產(chan) 品的味道/風味評估中的應用的潛在進一步擴展。這裏顯示了我們(men) 的細菌培養(yang) 監測結果。

材料和方法

多層 MB 芯片是使用透明和生物相容性材料玻璃和 PMMA 製造的。頂層和中間層是用 PMMA 製造的，互連層是使用 3M 雙麵膠帶（3M™ GPT-020F，聖保羅，明尼蘇達州 55144-1000，明尼阿波利斯，美國）製成的。用於(yu) 細胞培養(yang) 的芯片的底層由玻璃製成，其中阻抗傳(chuan) 感器是用商用 Agfa-Gevaert NV 納米銀墨水和 15% 的 Ag 納米顆粒和導電墨水打印的，使用壓電控製噴墨打印機 Fuji Dimatix DMP-3000。傳(chuan) 感器上覆蓋有一層薄薄的 SU-8 3000 Microchem 光刻膠。頂層包含入口/出口孔，其直徑適用於(yu) 在填充芯片時移液樣品。此外，在頂層還開了三個(ge) 直徑為(wei) 2.1 mm 的孔，用於(yu) 安裝 。傳(chuan) 感器通過孔與(yu) 樣品直接接觸，從(cong) 而能夠實時測量樣品中的參數。在芯片中間層製成的儲(chu) 液槽的樣品體(ti) 積為(wei) 1.8 mm。通過在胰蛋白腖大豆肉湯中接種細菌來製備大腸杆菌的過夜培養(yang) 物。之後，使用過夜培養(yang) 物製備 0.5 McFarlan 大腸杆菌培養(yang) 物 （1.5 x 10 CFU/mL），用於(yu) 在 MB 中培養(yang) 。我們(men) 將芯片與(yu) 一起留在 37 °C 的微生物培養(yang) 箱內(nei) （圖 1）。

監控 O₂， CO₂和培養(yang) 過程中的 pH 值

O 的測量結果₂， CO₂和微流控芯片中大腸杆菌培養(yang) 過程中的 pH 值如圖 2 所示。pH 值測量（圖 2a）在培養(yang) 大腸杆菌 3 小時期間給出了預期的結果。在初始滯後階段之後，細菌進入指數生長期，其特征是細胞倍增率，即生成時間。在實驗室中，大腸杆菌的生成時間從(cong) 大約 15 - 20 分鍾到 40 分鍾不等。因此，在實驗開始和結束時使用血細胞計數器測定大腸杆菌的濃度。圖 3 顯示了血細胞計數器的放大部分，即計數細胞單位的正方形。用微量移液管稱取 10 μL 並置於(yu) 血細胞計數器上。當計算所有方塊中的細胞單位總數時，計算平均值並確定芯片上的總濃度。使用光學顯微鏡進行細菌計數過程。細菌數量增加了近 13 倍。圖 2 顯示，t = 0 分鍾時的初始 pH 值（當我們(men) 在微流體(ti) 芯片內(nei) 接種細菌培養(yang) 物時）約為(wei) 7.3。三小時後，我們(men) 觀察到細菌培養(yang) 物酸化 （pH ~ 6.8） 和 CO 百分比增加₂，同時 % O 降低₂在孵化期間。這些圖表顯示了大腸杆菌生長的預期特征過程。在第一個(ge) 滯後生長期 （~ 1.5 h），pH 和 CO 沒有顯著變化₂.在這個(ge) 階段，消耗了氧氣。~ 1.5 小時後，CO₂水平呈指數級上升，O₂減少。在這個(ge) 階段，TBS 培養(yang) 基被細菌消耗，細胞進入對數生長期。氧含量隨著細胞數量的增加而降低，並在實驗期間降至零水平。這也表現在 CO 的增加₂.由於(yu) 氧氣有限，大腸杆菌細胞無法再在微流控芯片內(nei) 生長，該過程進入固定相。3 小時後，O₂水平下降到 3%，而 CO₂增加到 4 %。用於(yu) 微生物培養(yang) 監測的傳(chuan) 感器顯示出全麵的結果，並允許精確評估當前的培養(yang) 狀態。

結論

根據所呈現的結果，我們(men) 可以得出結論， 是一種監測基本參數 （O2、pH 值、CO2） 在微流控細菌培養(yang) 物中。 對於(yu) 培養(yang) 生物過程優(you) 化中的按規模縮小方法分析和過程監控非常重要。未來的實驗將針對培養(yang) 過程的持續監測和優(you) 化，檢查精油和抗生素對微生物反應器內(nei) 不同抗菌和抗真菌活性的影響。該研究將側(ce) 重於(yu) 尋找 pH 值、O 讀數之間的相關(guan) 性2和 CO2帶有附加傳(chuan) 感器（阻抗、光學和電化學）的傳(chuan) 感器集成到我們(men) 在研究所開發的微流體(ti) 生物反應器中，用於(yu) 測量介質、代謝物或生物質的電導率。